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作者:(责编:段赫迪(实习生)) 2022年09月30日 05:12

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截至目前,国家药监局新型冠状病毒应急医疗器械审批批准总计29款,其中,核酸检测类有18款,血清抗体类有11款,核酸检测和抗体/抗原检测是确认新冠病毒的重要手段,也是患者确诊的重要流程之一,但你知道他们的检测原理是什么?样本类型有哪些?检验又是一个怎么样的流程以及存在哪些问题 ?今天,小编来给大家科普一下~~

新型冠状病毒核酸检测

核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点,是确诊新冠肺炎的“金标准”,目前使用最广泛的是实时荧光定量RT-PCR技术。一般检测位于病毒ORF1ab和N基因上的两个靶标,同一份标本需满足双靶标阳性或重复检测为单靶标阳性或两种标本同时满足单靶标才能确认SARS-CoV-2病毒核酸阳性。

1、核酸检测试剂盒原理?

以病毒独特的基因序列为检测靶标,通过PCR扩增,使我们选择的这段靶标DNA序列指数级增加,每一个扩增出来的DNA序列,都可与我们预先加入的一段荧光标记探针结合,产生荧光信号,扩增出来的靶基因越多,累积的荧光信号就越强。而没有病毒的样本中,由于没有靶基因扩增,因此就检测不到荧光信号增强。所以,核酸检测其实就是通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否有病毒核酸。

2、核酸检测样本类型有哪些?

一般为鼻拭子、咽拭子、鼻咽拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。

3、五个步骤检测新型冠状病毒

检测程序需要经过五个步骤,取样、留样、保存、核酸提取、上机检测,这需要严谨的科学实验才能完成。

1. 用咽拭子擦拭咽后壁及双侧咽扁桃体处各5-10次,且不断旋转拭子;

2. 需要医务人员进行留样,将拭子头浸入细胞保存液中,折断尾部后立即旋紧管盖;

3. 保存,将样本管放入密封袋中及时送检,而送检过程中需要严格的运输环境,2-8摄氏度保存。

4. 操作核酸提取,将灭活病毒后的样本进行核酸提取,用于后续检测,可以采用自动化的设备,如核酸提取仪等。

5. 荧光PCR核酸检测,也就是上机器检测,将提取物进行荧光PCR扩曾反应,需要70—80分钟。

4、核酸检测存在哪些问题?

■ 假阴性,由于采样不当、标本保存不当、采用不同类型的标本以及使用不同厂家试剂都可能造成核酸检测结果“假阴性”而出现漏诊;■ 对检测设备或平台要求较高,高灵敏度的RT-PCR仪价格不菲,对实验室的洁净度和操作人员要求也较高;■ 核酸检测耗时较长,完成一个RT-PCR的检测通常需要4-6个小时,然而考虑到样本运输、大量样本积压的情况,通常最快24小时才可以报告结果。

因此当核酸检测阴性时,将IgM和IgG抗体检测增加进去,可以弥补核酸检测容易造成漏诊的缺点。

新型冠状病毒血清抗体检测

新型冠状病毒肺炎发病7天后,血清特异性抗体逐渐产生,首先出现的是免疫球蛋白IgM抗体,然后出现IgG抗体。因此,IgM抗体增高提示近期急性感染,IgG抗体增高提示既往感染。

血清学检测最大的优势在于方便快捷,检测时间较短,能够有效突破现有检测技术对人员、场所的限制,缩短检测用时,被写进了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》。如果疑似病例血清特异性IgM和IgG抗体阳性,IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期有4倍及以上升高,则可以诊断其感染了新冠病毒。

1、血清抗体检测试剂盒原理?

采用胶体金免疫技术,在结合垫处喷涂胶体金标记的重组新型冠状病毒抗原和质控抗体金标记物;NC膜上包被两条检测线(G线和M线)和一条质控线(C线)。M线包被有鼠抗人IgM单抗,G线包被有鼠抗抗人IgG单抗,C线包被有质控抗体。样本加到加样孔中,该样本在层析作用下将沿检测卡向前移动,如果样本中含有新冠状病毒IgM抗体,则该抗体与胶体金标记病毒抗原结合,形成夹心复合物,将会呈现阳性结果。如果样本中含有新型冠状病毒IgG抗体,则该抗体会与胶体金标记新型冠状病毒抗原结合,形成夹心复合物,将会呈现阳性结果。该检测卡还包含一条质控线(C线),用于判断层析过程是否顺利。

(图片源于:文献原文)

2、血清抗体检测样本类型有哪些?

一般为血液,包括血清、血浆和全血。

3、三个步骤检测新型冠状病毒

1. 打开检测卡铝箔袋,将检测卡取出并水平放置于桌面上;

2. 用移液器吸取血清/血浆/全血样本加到加样处,再用同样的方法吸取缓冲液滴加至检测卡加样孔中。

3. 等待15分钟,判读结果。

4、血清抗体检测存在哪些问题?

■ 假阳性,个别患者血液中含有类风湿因子、异嗜性抗体、自身抗体,以及药物和肿瘤细胞等,易造成试验的交叉反应,故偶现假阳性的结果;■ 假阴性,由于血清抗体检测方法存在一定的窗口期以及检测试剂盒的灵敏度不同会出现假阴性结果。

因此血清抗体检测仅用作对新冠病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测,不能单独作为诊断指标用于筛查。联合使用血清抗体检测与核酸检测,有助于提高疾病的检出率,尽可能地找出确诊患者,更有利于疫情的控制。

核酸与IgG、IgM抗体联合检测的结果解读

新型冠状病毒抗原检测

新型冠状病毒抗原检测可直接检测出人体样本中是否含有新型冠状病毒,诊断快速、准确、对设备和人员要求低,采用双抗夹心法,使用两种抗原特异性抗体去识别和结合一个靶点抗原的不同表位,则可以大大降低交叉反应的几率,从而有效提高其特异性。

1、抗原检测试剂盒原理?

新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白和S蛋白等抗原,可作为免疫原,在病毒感染人体后,刺激浆细胞产生特异性抗体。依据双抗夹心ELISA原理,样本滴加在样本垫上,通过液相层析依次通过结合垫,NC膜上的检测线(T线)和质控线(C线)。结合垫内含有标记的抗原特异性抗体,可以与样本中的抗原(病毒蛋白)发生结合,当液流到达检测线(T线)时,固定在这条线上的第二种抗原特异性抗体再次与抗原结合,将会呈现阳性结果。质控线(C线)包被IgG抗体,可以结合样本垫中抗体,用于判断层析过程是否顺利。

2、抗原检测样本类型有哪些?

一般为感染部位的样本,例如口咽拭子、鼻咽拭子、痰液、血清、血浆等。

3、四个步骤检测新型冠状病毒

1. 将标本处理液滴至标本处理管中;

2. 将取样拭子搅拌并挤压管壁,是标本充分洗脱至处理液中;

3. 取出检测卡,向圆孔中加样;

4. 等待15分钟,判读结果。

4、抗原检测存在哪些问题?

■ 假阴性,抗原检测需要更高的敏感性,由于新型冠状病毒主要侵犯肺泡等下呼吸道,所以从鼻咽、口咽等上呼吸道取样,不一定能取到病原体,或者取样中所含病毒数量较少,这些因素都可造成漏检;■ 制备工艺繁琐耗时,研发抗原试剂盒需要先将重组抗原制备出来,再打到小鼠体内制备单克隆抗体,约需要两三个月,如果制备出的抗体性能不好还需要重新制备,又需要两三个月。

因此抗原检测方法尚未成熟,目前没有抗原检测试剂盒被国家药监局批准注册。

联合检测

新型冠状病毒核酸/抗体/抗原检测各有侧重,不能相互替代,多种检测方法联合应用,互为补充,将分子生物和免疫水平检测相结合,发挥各自优势,提高灵敏性与特异性,可有效缩短检测窗口期,提高阳性检出率,为各种可能的风险人群提供双重保障。

参考文献:Zhengtu Li,Yongxiang Yi et al.Development and clinical application of a rapid IgM‐IgG combined antibody test for SARS‐CoV infection diagnosis. J Med Virol.2020;1-7

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